中忍考试 十二年后，此时的大蛇丸已进入中年时期，他与第四代风影·罗砂结盟，二人联手进攻木叶，其行动称为“木叶崩溃计划”。
他以部下药师兜作间谍潜入木叶隐村，而他自己也伪装成一名来自草隐村的女中忍考生混入木叶隐村。在死亡森林中大蛇丸遇到宇智波佐助，因为大蛇丸打算以佐助的身体当转生容器，所以给了佐助天之咒印，并预言佐助将会为报宇智波一族被灭族之仇去找他追求力量。
大蛇丸刺杀四代风影 后来，他暗杀第四代风影，并伪装成风影，让自己完全控制砂忍的行动。 在第三场中忍正式考试中，伪装成四代目风影的大蛇丸受三代目火影特意邀请，来到木叶隐村中忍选拔会场与三代目火影一同观赏这场淘汰赛，期间由大蛇丸的四名得力部下多由也、次郎坊、鬼童丸、左近右近伪装成两名砂隐忍者作为护卫，由于宇智波佐助为赶来参加考试，三代火影多次推迟考试时间后佐助仍未来参加，随后三代火影决定取消其资格，但因“四代目风影”的劝阻，三代火影打消了此念头。
木叶崩溃行动 对战三代火影 五十岁时他跟木叶的原盟友·第四代风影结盟，二人合谋攻击木叶，其行动称为“木叶崩溃计划”。大蛇丸则另有图谋，在兜和君麻吕的帮助下，大蛇丸暗杀了罗砂并伪装成风影的模样，他成功挑起砂忍和木叶忍者之间的战斗，直到中忍考试结束，马基等人才发现罗砂的尸体。 他以部下药师兜作间谍潜入木叶忍村，而他自己也伪装成一名来自草忍的中忍试女考生混入该村。
并于死亡森林中遇到宇智波佐助，由于打算以他的身体作转生容器，故意给了佐助天之咒印，并预言佐助将会为报宇智波一族被灭之仇去找他寻求力量。
后来，他成功挑动起砂忍和木叶忍者之间的战斗后，立时撕下伪装，在由音忍四人众所维持的结界里，跟第三代火影挑战。
在激战中，三代火影使用“忍术·瓦片手里剑”攻击大蛇丸，但轻易被大蛇丸躲过，大蛇丸立即反击、以“潜影蛇手”袭击三代火影；之后三代火影使用“土遁·土流大河”、“土遁·土龙弹”及“火遁·火龙弹”连续攻击大蛇丸，但被大蛇丸使用土替身躲过。
召唤初代二代 之后，三代火影使用“手里剑影分身之术”之时，大蛇丸使用秽土转生将初代火影与二代火影召唤出来，他们的意志被完全抹杀，被迫参加战斗，二人无法发挥原本的实力。
在战斗过程中，日斩使用“火遁·火龙炎弹”从口中吐出火焰向兄弟二人扑面而来，面对火遁的攻势，第二代火影使用水遁·水阵壁从口中猛烈喷出如海浪一般的水之墙，抵挡住日斩的火遁攻击。
紧接着，第二代火影双手合十后，使用水遁·水冲波在一瞬间凭空召唤出犹如龙卷风般快速旋转上升的水，之后水犹如瀑布一般扩散并向下冲击日斩，日斩则使用土遁·土流壁筑成巨岩阻挡洪水；但就在从岩石返归城楼之际，初代火影使用木遁秘术·树界降诞从地上快速生长出多棵树木，树木连根拔起，在一瞬间制造出一片森林，并且树枝牢牢的捆绑住日斩的双手与双脚。